"Первые в области разработки промышленных биотехнологий
редких и лекарственных растений"

История коллектива.

   Российские исследователи стояли у истоков исследования культур клеток высших растений.

Приоритет идеи использования культур клеток лекарственных растений для медицинских целей принадлежит основателю работ в этой области член-корр. АН СССР Р.Г.Бутенко (ИФР РАН). В 70-х годах прошлого века в СССР впервые в мире было организовано промышленное получение биомассы каллусной культуры клеток женьшеня и продуктов на ее основе, в том числе медицинской настойки «Биоженьшень». Также Р.Г. Бутенко была основателем Всероссийской Коллекции Культур Клеток Высших Растений (ВРККК ВР ИФР РАН), которая в настоящее время состоит в Европейской Ассоциации коллекций культур (ЕССО) и включена в число Национальных коллекций культур мира.

К настоящему времени коллективом в рамках работы в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН получены различные культуры клеток - продуценты биологически активных веществ, в том числе женьшеня японского и ряд штаммов диоскореи дельтовидой, продуцирующих гинзенозиды и фуростаноловые гликозиды соответственно. Все штаммы-продуценты паспортизированы и депонированы в ВРККК ВР ИФР РАН. Так, проведено изучение ростовых характеристик и вторичного метаболизма для различных культур клеток, в том числе Panax ginseng, Panax japonicus, Rhaponticum carthamoides, Ajuga reptans , Serratula coronata, Stevia rebaudiana, Stephania glabra, Polyscias filicifolia. Оптимизированы условия их роста по составу сред и условиям культивирования.

Разработаны системы выращивания суспензионных культур клеток в различных режимах культивирования (периодическом, полупроточном, проточном (хемостат, закрытый проток) в биореакторах различной конструкции и объема.

Получены высокопродуктивные штаммы культур клеток диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea, женьшеня настоящего Panax ginseng и женьшеня ползучего Panax japonicus var. repens, с высоким и стабильным содержанием целевых БАВ, определены условия их стабильного синтеза.

Получены каллусные и суспензионные культуры клеток разных видов тисса - Taxus canadensis, Taxus baccata, Taxus cuspidata, Taxus Media – продуцентов противоопухолевых дитерпеноидов (таксоидов). С помощью ВЭЖХ, капиллярного электрофореза и ВЭЖХ-масс-спектрометрии показано, что полученная культура клеток Taxus baccata сохранила способность к синтезу таксоидов (паклитаксел, баккатин III).

Проведенные фундаментальные исследования послужили основой разработки эффективных биотехнологий на основе культур клеток in vitro. Полученные штаммы суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной являются сверхпродуцентами и содержат при культивировании в лабораторных условиях до 10% стероидных гликозидов фуростанолового ряда (ФГ) в основном протодиосцин и дельтозид. Уникальной особенностью штаммов является полное отсутствие спиростаноловых гликозидов (СГ), характерных для интактных растений и имеющих противоположную по сравнению с ФГ биологическую активность. Разработан и защищен патентами способ выделения фуростаноловых гликозидов из биомассы клеток с чистотой 60% без применения препаративной хроматографии. Совместно с медицинскими учреждениями (МРНЦ РАМН, Кардиоцентр РАМН) изучена биологическая активность выделенных фуростаноловых гликозидов. Опытные образцы ФГ обладали выраженными иммуномодулирущими свойствами при опухолеассоциированном, постстрессорном, пострадиационном иммунодефицитах и выраженной профилактической активностью последствий стресса, воздействия противоопухолевых цитостатиков и радиации. При пероральном введении активность была выше, чем у тактивина, тимогена, декариса, арбидола. Показаны также противоатеросклеротические и sex-стимулирующие свойства экстрактов клеточной биомассы. Помимо медицинского и ветеринарного применения, препараты на основе фуростаноловых гликозидов могут быть использованы в сельском хозяйстве, так как по данным института паразитологии РАН они повышают устойчивость растений к фитофторе и нематоде. В Кардиоцентре РАМН были начаты доклинические испытания выделенных фуростаноловых гликоиздов, однако из-за недостатка финансирования они не были завершены. По полученным предварительным результатам, препараты на основе фуростаноловых гликозидов, выделенных из культуры клеток диоскореи дельтовидной, не токсичны и не обладают мутагенным, онкогенным, эмбриотоксическим действием. Вследствие высокого содержания в штамме ДМ-0,5 фуростаноловых гликозидов (до 10% в сухой биомассе) и отсутствия спиростаноловых гликозидов, альтернативные способы получения подобных препаратов практически невозможны (в интактных растениях содержатся в основном спиростаноловые гликоизиды, содержание фуростаноловых соединений обычно не превышает 1%, их качественный состав более сложен, что предполагает отличия в биологической активности).

Полученный коллективом в ИФР РАН штамм культуры клеток женьшеня японского отличается от имеющихся аналогов высоким содержанием гинзенозидов (тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда) – уникальных биологически-активных веществ женьшеня. Содержание этих веществ достигает в клеточной биомассе 2 – 3%, что сопоставимо с их содержанием в корне интактных растений. Для экстрактов женьшеня японского показано антинеопластическое, антистрессорное, антиоксидантное и противоопухолевое действие. Гликозиды женьшеня повышают устойчивость к различным инфекциям и токсическим веществам, активизируют ослабленные функции желез внутренней секреции, в частности половых желез, оказывают иммунотропное, противодиабетическое и противолучевое действие.

Коллективом разработаны принципы масштабирования выращивания культур клеток высших растений. Осуществлено масштабирование выращивания культур клеток Polyscias filicifolia, Dioscorea deltoidea и Panax japonicus var. Repens до биореакторов полупромышленного объема (630 литров). Результаты проведенных работ по выращиванию в биореакторах показали, что штаммы-продуценты являются лабильными системами, достаточно чувствительными к смене систем культивирования и претерпевающими определенные перестройки в результате изменений условий окружающей среды. Уровень накопления биомассы и вторичных метаболитов зависит от ряда характеристик используемых аппаратов (прежде всего технических – интенсивности аэрации и перемешивания, конструктивных особенностей) и условий культивирования (состава сред, объему инокулюма), а также обусловлены различными адаптационными способностями изученных штаммов к стрессам аппаратурного культивирования. Показана необходимость адаптировать и оптимизировать режимы и условия выращивания (интенсивность перемешивания и аэрации) для каждой конкретной системы культивирования в соответствии с потребностями штаммов-продуцентов. Это соответствует данным литературы, которые подтверждают отсутствие однозначно положительных результатов при попытках разработать простые и надежные критерии масштабирования для геометрически и конструкционно неподобных систем. Важно отметить воспроизводимость основных ростовых и биосинтетических характеристик для всех отобранных культур клеток при переходе к аппаратурному выращиванию. Выращивание различных суспензионных культур клеток с использованием «отъемно-доливного» метода в лабораторных биореакторах повторяли неоднократно при сохранении удовлетворительных физиологических показателей штаммов.

В рамках работ с ВККК ВР ИФР РАН сотрудниками коллектива разработаны стандартизованные методики оценки роста, жизнеспособности, биохимической характеристики, а также цитогенетической оценки культур клеток растений. Разработаны методики криосохранения суспензионных культур клеток высших растений – продуцентов ценных вторичных метаболитов, а также методики криосохранения меристем ценных с/х культур.

Разработаны проект баз данных по коллекциям культур растительных клеток и проект правил предоставления доступа и передачи линий культур клеток и меристем высших растений в соответствии с международными соглашениями и стандартами. Также были разработаны общие для ЕврАзЭс унифицированные правила депонирования, предоставления доступа и передачи штаммов культур клеток и меристем высших растений совместно с Государственным научным учреждением «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси». Сотрудниками Коллектива проводятся практические занятия, стажировки и школы-семинары по методам получения и характеристики культур клеток высших растений и меристем с/х культур (в частности, в рамках Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология»).