"Первые в области разработки промышленных
биотехнологий |
|
Главная | Услуги | Продукция | История коллектива | О компании | Партнерство | Контакты |
|
Культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall): |
Главные биологические и фармакологические свойства стероидных гликозидов диоскореи касаются цитотоксической, противоопухолевой и противогрибковой активности, они являются основой для производства стероидных гормонов с противовоспалительной, андрогенной, эстрогенной и контрацептивной активностью. [Vanisree M., Lee C.-Y., Lo S.-F., Nalawawade S. M., Lin C. Y., Hsin-Sheng T. 2004. Bot. Bull. Acad. Sin., 45, pp. 1-22]. У стероидных гликозидов была обнаружена способность тормозить рост некоторых форм злокачественных образований; снижать уровень холестерина в крови и стимулировать овуляторные процессы у животных, а также антигрибная, антимикробная и антивирусная активности. Стероидные гликозиды оказались эффективными при лечении ревматизма, бронхиальной астмы, гемолитической анемии, гемодиатеза. Важная роль отводится стероидным гликозидам в усилении устойчивости растений к стрессовым факторам среды и фитопатогенам [Васильева И.С., Пасешниченко В.А. (2000). Успехи биологической химии, 40, с.153-204]. В медицине стероидные гликозиды используют в качестве гипотензивных (диоспонин, полиспонин), иммуномодулирующих, адаптогенных, укрепляющих препаратов (трибестан, витатон и др.). В Институте Физиологии Растений были получены штаммы суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной с синтезом фуростаноловых гликозидов (протодиосцина и дельтозида) – до 10 % от сухой массы клеток при отсутствии спиростаноловых гликозидов. В среднем суммарное содержание протодиосцина и дельтозида варьирует в пределах 3-5 % от сухой массы клеток (это на порядок выше среднего содержания ФГ в интактных растениях). Соотношение протодиосцин/дельтозид – в основном 60/40, один из штаммов (ИФР-ДМ-05-03) отличается преимущественным синтезом протодиосцина на фоне следового содержания дельтозида. На данный момент отработана технология выращивания биомассы культуры клеток диоскореи дельтовидной в биореакторах промышленного объема (630 л) в оптимальных режимах культивирования с сохранением удовлетворительных ростовых и биосинтетических показателей. По результатам исследований составлен технологический регламент получения биомассы культуры клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall) глубинным способом в пилотных и промышленных установках, разработаны Технические условия (ТУ) Биологическая активность фуростаноловых гликозидов суспензионной культуры клеток диоскореи дельтовидной: Доказано, что ФГ оказывают регулирующее действие на артериальное давление, и уровень липидов в крови. Так, при назначении экстрактов содержащих ФГ кроликам, получавшим обогащенную холестерином пищу, отмечали улучшение ультраструктуры коры головного мозга и снижение митохондриальной дегенерации в нейронах, тогда как у контрольной группы, не принимавшей ФГ, происходили выраженные дегенеративные ультраструктурные изменения. Экстракты содержащие ФГ также улучшали липидный профиль и структуру эндотелия. [Guo Y.et al. Am.J.Clin.Med. 2007. 35(2). P.:309-316] [Altug M. et al. Acta Histochem. 2009.Mar] Антиоксидантные свойства фуростаноловых гликозидов культуры клеток D. deltoidea, представленных дельтозидом и протодиосцином, изучали в модельных экспериментах in vitro по изменению активности основных ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, каталазы, а также по изменению биомеханических и гидротропных свойств кожи в условиях УФ–излучения. Было отмечено значительное увеличение активности всех ферментов при достаточно низких концентрациях фуростаноловых гликозидов (10–4 мг/мл), к тому же наблюдали увеличение модуля упругости и снижение остаточной деформации кожи, что характерно для препаратов актопротекторного действия [Дубинская В.А., Васильева И.С., Минеева М.Ф., Николаева С.С., Пасешниченко В.А., Ребров Л.Б., Носов А.М. // II Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования». 1997. Пущино. С. 932—934.] [Дубинская В.А., Николаева С.С., Ребров Л.Б., Васильева И.С., Пасешниченко В.А. // Труды научно– исслед. и учебно–методич. центра биомедицинских технологий ВИЛАР. 1997. № 8. С. 48—52.]. Благодаря этим свойствам фуростаноловые гликозиды могут быть рекомендованы в качестве протектора, способного защищать кожу от вредных атмосферных воздействий, а также предупреждать ее старение. При исследовании влияния фуростаноловых гликозидов на синтез биополимеров (белок, РНК, ДНК) было показано, что при дозе стероидного гликозида 30 мг/кг количественное соотношение биополимеров в ткани сердечной мышцы значительно изменилось: в 4 раза увеличился показатель РНК/белок (х103), возрастало соотношение РНК/ДНК (с 0,22 до 1,44). Это свидетельствует о том, что в сердечной мышце происходит активный синтез белка, Подтверждением этому является двухкратное увеличение содержания оксипролина в сердечной мышце при той же дозе фуростанолового гликозида (30 мг/кг). Масса сердца при этом остается неизменной [Дубинская В.А., Стрелкова Л.Б., Васильева И.С., Николаева С.С., Ребров Л.Б. Пасешниченко В.А. // Бюлл. эксперимент. биолог. и медицины. 1998. Т. 126. С. 178—181.]. Возможно благодаря своей способности активизировать синтез коллагеновой фракции белков в сердечной мышце фуростаноловые гликозиды могут найти применение в кардиологии для ускорения репаративных процессов в сердце при лечении инфаркта миокарда. Положительное влияние ФГ на ремоделирование миокарда после инфаркта миокарда показано также в работе [Cek S.et al. Pak.J.Biol.Scien.2007. 10(5). P.:718-725] Стероидные гликозиды действуют на репродуктивную систему животных, стимулируя овуляцию и сперматогенез [Васильева И.С., Пасешниченко В.А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31. С. 238—242.], [Заркова С. // Тезисы VI Национальной конференции по фармаколог. и клинике болгарских лекарств. Пловдив. 1984.], [Kintia P.K. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y.–London: Plenum Press. 1996. Vol. 404. P. 309—334.]. Испытание фуростаноловых гликозидов культуры клеток D. deltoidea на крысах и кроликах показало, что стероидные гликозиды в дозах от 1,0 до 3,0 мг/кг при многократном (6—8 раз) введении стимулировали овуляцию у лабораторных животных [Васильева И.С., Пасешниченко В.А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31. С. 238—242.], [Заркова С. // Тезисы VI Национальной конференции по фармаколог. и клинике болгарских лекарств. Пловдив. 1984.]. Кроме лабораторных испытаний, фуростаноловые гликозиды диоскореи применили в ветеринарии для лечения бесплодия у крупного рогатого скота при гипофункции яичников коров. Однократное введение фуростаноловых гликозидов в дозе 800 мг/корову приводило к увеличению оплодотворяемости в 2—2,5 раза [Васильева И.С., Пасешниченко В.А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31. С. 238—242.]. Антиоксидантные свойства фуростаноловых гликозидов были использованы для криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных. Было показано, что ФГ снижают перекисное окисление липидов на 9—15% и увеличивают подвижность сперматозоидов после размораживания на 40% [Калистру В.Д., Наук В.А., Кинтя П.К. // Изв. АН Молд. ССР. 1982. № 4. С. 65—66.]. У фуростаноловых гликозидов культуры клеток D. deltoidea при действии на разные субпопуляции лимфоцитов обнаружили высокую иммуномодулирующую активность. На культуре изолированных лейкоцитов было показано, что действие фуростаноловых гликозидов зависит от концентрации, вызывая либо стимуляцию, либо супрессию пролиферативного ответа лимфоцитов на митогенный стимул фитогемагглютининов (ФГА). Наибольшее стимулирующее действие гликозиды проявляли в концентрации от 0,01 до 0,1 мкг/мл, а в концентрации от 1,0 до 100 мкг/мл — оказывали ингибирующее действие на пролиферативный ответ лимфоцитов, индуцируемый ФГА [Васильева И.С., Пасешниченко В.А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31. С. 238—242.]. Для фуростаноловых гликозидов из культуры клеток D. deltoidea была обнаружена способность стимулировать синтез белков и активизировать некоторые ферменты (сукцинат–лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы), связанные с обменом энергии [Димова П., Тасков М., Матев Т. // Медико–биологическая информация. 1988. № 1. С. 11—15.], [Тасков М., Шейтанов М., Христов Т. // Медико–биологическая информация. 1987. № 2. С. 22—25.], [Дубинская В.А., Стрелкова Л.Б., Васильева И.С., Николаева С.С., Ребров Л.Б. Пасешниченко В.А. // Бюлл. эксперимент. биолог. и медицины. 1998. Т. 126. С. 178—181.]. Наиболее сильно анаболическое действие фуростаноловых гликозидов, связанное со значительным приростом массы тела животных, проявилось при дозах сапонина от 5 до 10 мг/кг. Вес животных увеличивался почти в 3,5 раза. Биопестицид со свойствами фитоиммуностимулятора (как препарат, индуцирующий устойчивость с/х растений к фитопатогенам, со свойствами стимулятора прорастания семян) Использование препаратов на основе фуростаноловых гликозидов диоскореи дельтовидной индуцирует естественный иммунитет и стимулирует защитные свойства растительного организма (индуктор и стимулятор иммунной системы). Обрабатывают семена, клубни и вегетирующие растения. Экологически безопасны – не накапливаются в почве, не токсичны, стабильны при хранении, получают биотехнологическим способом; отличаются полифункиональностью действия (стимулируют прорастание, обладают ростстимулирующим эффектом на фоне защиты от патогенов); при применении используется стандартный инвентарь. При изучении влияния стероидных гликозидов диосгенина, выделенных из корней D. Deltoidea на зооспоры Phytophtora infestans — фитопатогенных грибов растений — было отмечено, что дельтозид тормозит их рост и прорастание. [Васюкова Н.И., Пасешниченко В.А., Чаленко Г.И., Давыдова М.А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1977. Т. 13. С. 172—176]. Изучение антибактериальной активности дельтозида, выделенного из D. deltoidea, показало, что в концентрации 0,02 г/мл ингибировал цитохромный участок дыхательной цепи бактериальной клетки Micrococcus lysodeikticus. [Лукоянова М.А., Пасешниченко В.А., Ермаченко В.А. // ДАН СССР. 1978. Т. 239. С. 736—739.], [Тургенбаева Д.А., Ермаченко В.А., Харатьян Е.Ф., Пасешниченко В.А., Лукоянова М.А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1983. Т. 19. С. 788—794.]. Таким образом, стероидные гликозиды растений можно рассматривать как естественный фактор защиты их от фитопатогенов. Неактивные против грибов и микробов фуростаноловые гликозиды, при внедрении в растительную клетку патогена под действием β–гликозидаз образуют активную спиростаноловую форму стероидных гликозидов, которые ингибируют развитие грибов или других патогенных микроорганизмов [Пасешниченко В.А. // Итоги науки и техники. Биологическая химия. М.: ВИНИТИ. 1987. 196 с.]. Иммуномодулирующее (регуляторное) действие оказывали стероидные гликозиды на жизнеспособность пыльцы межвидовых гибридов томатов. При этом наблюдали как стимуляцию, так и ингибирование процесса прорастания пыльцы. В большой концентрации стероидные гликозиды являлись сильными ингибиторами прорастания, а при разбавлении — либо не влияли, либо стимулировали ее жизнеспособность [Kintia P.K. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y.–London: Plenum Press. 1996. Vol. 404. P. 309—334.]. Стимуляция роста и фитоиммунитета растений фуростаноловыми гликозидами позволяет рассматривать эти соединения как природные адаптогены. [Васильева И.С., Удалова Ж.В., Зиновьева С.В., Пасешниченко В.А. // Прикл.биохимия и микробиол. 2009. Т.45. № 5. С. 517-526] В результате обработки семян растворами фуростаноловых гликозидов значительно повышается их всхожесть, скорость прорастания, адаптация растений к стрессовым условиям окружающей среды, устойчивость к болезням. При замачивании семян томатов в 1х10–3 М растворе фуростаноловых гликозидов из культуры клеток D. deltoidea их прорастание ускоряется на 2—3 сут. [Зиновьева С.В., Васильева И.С., Удалова Ж.В., Пасешниченко В.А. // Доклады РАН. 1995. Т. 342. С. 131—133.]. Обработка семян сахарной свеклы в растворе стероидных гликозидов увеличивает урожайность на 30—40%, всхожесть некондиционных семян повышается на 30% [Кинтя П.К. // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. 1988. Т. 33. С. 584—585.]. При изучении индуцированной стероидными гликозидами устойчивости растений к вирусной инфекции было показано, что стероидные гликозиды индуцируют образование новых белков, а также повышают активность РНК–азы в 2,5 раза. Увеличение активности ключевого фермента клетки РНК–азы, вероятно, направлено на деполимеризацию РНК вируса. Это подтверждается опытами по изучению изменения активности РНК–азы в листьях томатов, зараженных ВТМ, под действием стероидных гликозидов. [Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В., Балашова Н.Н., Балашова И.Т., Суружиу А.И., Лях В.А. // Строение и биологическая активность стероидных гликозидов ряда спиростана и фуростана. Кишинев: Штиинца. 1987. 142 с.]. Таким образом, стероидные гликозиды способны изменять метаболизм зараженного вирусом растения, активизируя его защитные реакции и индуцируя устойчивость к вирусной инфекции. Изменение белкового метаболизма является отражением тех сдвигов, которые происходят на ультраструктурном уровне. При заражении вирусом именно в митохондриях иммунных и устойчивых сортов синтезируются новые белки (см. ссылки в [Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В., Балашова Н.Н., Балашова И.Т., Суружиу А.И., Лях В.А. // Строение и биологическая активность стероидных гликозидов ряда спиростана и фуростана. Кишинев: Штиинца. 1987. 142 с.])[ Васильева И.С., Зиновьева С.В., Удалова Ж.В., Пасешниченко В.А., Сонин М.Д. // Докл. РАН 2004. Т. 397 №1, стр.117-119.] [Зиновьева С.В., Удалова Ж.В., Васильева И.С., Ванюшкин С.А., Волкова Л.А., Носов А.М., Пасешниченко В.А. // Прикл. биохимия и микробиол. 2005, Т. 41, №3, С.347-353.] [Байчева О.; Дамянова А.; Зиновьева С.В.; Удалова Ж.В.; Владов И. ; Васильева И.С.; Салкова Д // Материалы второго Международного научно-практического совещания "Паразитические нематоды растений (биоразнообразие, изучение, коллекции)", 26-28 апреля 2010 г. / Всерос. науч.-исслед. ин-т фитопатологии. - Большие Вяземы, 2010.] Кроме этого вирусная инфекция нарушает структуру хлоропластов неустойчивых сортов растений. Обработка зараженных растений стероидными гликозидами восстанавливает ультраструктурную организацию клетки, нарушенную вирусной инфекцией [Shvets S.A., Gutsu O.N., Kintia P.K. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y.–London: Plenum Press. 1996. Vol. 405. P. 247—257.] . Так же было отмечено, что фуростаноловые гликозиды способны воздействовать на состав хлоропластных фотосинтетических пигментов. На растениях томатов, зараженных галловой нематодой (модель биогенного стресса) и обработанных фуростаноловыми гликозидами, наблюдали значительное увеличение содержания пигментов фотосинтеза (на 15,7%), при этом происходило возрастание общего содержания каротиноидов и изменение их соотношения, особенно пигментов виолаксантинового цикла (ВКЦ) — увеличение доли зеаксантина (в 2,7 раза), антераксантина (в 1,3 раза) и виолаксантина (в 3,6 раза) [Васильева И.С., Зиновьева С.В., Ершов Ю.В., Пасешниченко В.А. // Докл. РАН. 2000.] [Васильева И.С., Зиновьева С.В., Удалова Ж.В. // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. т. 39. с. 689-696] По существующим представлениям ВКЦ может быть частью регуляторной системы при фотосинтезе, важную роль в которой отводят зеаксантину, способному предохранять фотосинтетический аппарат от фотодеструкции в условиях стресса растения [Маслова Т.Г., Попова И.А., Корнюшенко Г.А., Королева О.Я. // Физиолог. растений. 1996. Т. 43. С. 437—449.], [Demmig–Adams B. // Biochim. Biophys Acta. 1990. Vol. 1020. P. 1—24.]. Инвазия томатов галловой нематодой приводит к стрессу и интенсификации окислительных процессов в тканях растений [Васильева И.С., Зиновьева С.В., Пасешниченко В.А., Удалова Ж.В. // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. Т. 34. С. 560—563.]. Для фотосинтетического аппарата это выражается в возрастании содержания более окисленного ксантофилла виолаксантина, содержание которого увеличивается на 44,3% [Васильева И.С., Зиновьева С.В., Ершов Ю.В., Пасешниченко В.А. // Докл. РАН. 2000]. По–видимому в присутствии фуростаноловых гликозидов (антиоксидантов) создаются условия, при которых виолаксантин путем дезэпоксидирования через антераксантин превращается в зеаксантин. Наблюдаемое значительное снижение доли β–каротина в сумме каротиноидов и возрастание доли ксантофиллов вероятно можно объяснить тем, что фуростаноловые гликозиды путем сдвига метаболизма каротиноидов в сторону образования пигментов ВКЦ, играющих защитную роль, могут способствовать стабилизации фотосинтетического аппарата, что особенно важно в стрессовых условиях. Таким образом, повышение устойчивости растений к патогенам под действием стероидных гликозидов связано с изменениями, происходящими в клетке растения на биохимическом уровне. Предварительная обработка семян томатов 0,1%–ным раствором фуростаноловых гликозидов диоскореи повышала устойчивость растений к фитогельминту галловой нематоде Meloidogyne incognita [Васильева И.С., Зиновьева С.В., Пасешниченко В.А., Удалова Ж.В. // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. Т. 34. С. 560—563.]. Для выяснения причины действия стероидных гликозидов на патогенность фитогельминтов, опосредованного растением, были изучены некоторые биохимические показатели зараженного растения, а также морфо–физиологические характеристики галловой нематоды. Было показано, что значительное снижение жизнеспособности паразита сопровождается повышением иммунных характеристик растения. Уже через 3 ч после обработки листьев томатов стероидными гликозидами активность пероксидазы в корнях увеличивается в 2 раза, что свидетельствует о быстрой передаче сигнала, вызванного стероидным гликозидом, из надземных органов растения в корни, где вследствие этого возрастает иммунитет к фитогельминтам [Васильева И.С., Зиновьева С.В., Пасешниченко В.А., Удалова Ж.В. // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. Т. 34. С. 560—563.]. Известно, что галловая нематода — стеринзависимый паразит. Заражение растений томатов этим фитогельминтом сопровождается значительным повышением (в 1,2 раза) содержания стеринов в корнях. У растений, обработанных стероидным гликозидом, инвазия нематодой не вызывает увеличения пула стеринов, их количество остается на таком же уровне, как и в здоровых корнях. Подавление биосинтеза стеринов, по–видимому, сказывается на жизнеспособности галловой нематоды, так как известно, что этот стеринзависимый паразит использует в своем цикле развития экзогенные стерины [Chitwood D.J., William R.L. // Lipids. 1991. Vol. 26. P. 619—627.]. Наблюдаемая перестройка стероидного биосинтеза под влиянием фуростаноловых гликозидов вызывает переключение путей биосинтеза со стеринов на другие изопреноиды, токсичные для фитогельминтов, например сесквитерпеновый фитоалексин ришитин, как это было установлено при заражении нематодой устойчивых сортов томатов [Zinovieva S.V., Ozeretskovskaya O.L., Iliinskaya L.I., Vasyukova N.I., Udalova Zh.V. // Russian J. Nematology. 1995. Vol. 3. P. 65—67.]. Применение стероидных гликозидов для лечения фузариоза — болезни сельскохозяйственных злаковых культур — вызываемой грибами рода Fusarium Link позволяет не только ингибировать рост грибов и их спорообразование, но, благодаря их фитогормональным свойствам, ускорять прорастание и главным образом индуцировать устойчивость растений путем усиления их фитоиммунитета [Hoagland R.E., Zablotowicz R.M., Reddy K.N. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y.–London: Plenum Press. 1996. Vol. 405. P. 57—73.], [Kintia P.K., Lupashku G.A. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y.–Lon2 don: Plenum Press. 1996. Vol. 405. P. 75—82.]. Сапонины, внесенные в почву, способны изменять ее микрофлору, снижать поражаемость растений корневой гнилью, вызываемой Phytophthora cinnamoni [Hoagland R.E., Zablotowicz R.M., Reddy K.N. // Adv. in Exp. Med. and Biol. N.Y.–London: Plenum Press. 1996. Vol. 405. P. 57—73.]. При изучении действия стероидных гликозидов фуростанолового ряда на взаимоотношения в системе "растения - паразитические нематоды" установлено, что они обладают высокой антистрессовой активностью, оказывая стимулирующее влияние на зараженные растения и ингибирующее на паразитов. Действующая концентрация фуростаноловых гликозидов на систему паразит-хозяин зависит от индивидуальных свойств партнеров. Оптимальные действующие концентрация для систем: "томаты - галловая нематода, М. incognita" - 1 мг/мл, "огурцы - галловая нематода" - 0,01 мг/мл, "томаты - цистообразующая нематода Globodera rostochiensis" - 0,1 мг/мл, "картофель - G. rostochiensis, G. pallida" - 1 мг/мл. Замачивание семян перед посадкой или опрыскивание растений ФГ в установленных концентрациях приводит к снижению заражённости корней нематодами (в 1,9-3,5 раза галловой нематодой и в 1,2-1,5 раза картофельной цистообразующей нематодой). При этом происходит стимуляция роста и развития растений. По своим физиологическим и биохимическим показателям восприимчивые растения, обработанные препаратом ФГ, приобретают свойства устойчивых. Установлено, что приобретенная под влиянием ФГ устойчивость к нематоде обусловлена как общей активизацией биохимических процессов, так с изменениями изопреноидного биосинтеза и воздействиями на внутриклеточные мембраны, в состав которых входят стерины (в цитоплазме) или изопреноидные пигменты (в пластидах). При обработке растений ФГ возрастала активность пероксидазы в корнях (в 1,6 раза), снижалось общее количество стеринов (в 1,5 раза) и изменялся их качественный состав, в сторону, неблагоприятную для жизнедеятельности нематод, увеличивалось количество хлоропластных пигментов в инвазированных растениях (в 1,2 раза). Применение препарата ФГ в производственных условиях показало эффективность их действия в отношении нематод (ТЭ до 71,4%) и на продуктивность томатов и огурцов (прибавка до 3,6 кг/м ) [Удалова Ж.В., 2000, дисс. «Действие стероидных гликозидов на взаимоотношение растений и фитонематод и стрессоустойчивость растений»] |